Organizarea activitatii in laboratorul de biochimie

1. Organizarea activitatii in laboratorul de biochimie 

1.1. Reguli de protectie/lucru in laboratorul de biochimie 

In laboratorul de biochimie se folosesc frecvent substante toxice si vatamatoare  si din acest motiv este de preferat sa se lucreze cu volume mici de solutii.  Pentru buna functionare a laboratorului se impune respectarea urmatoarelor  reguli: 

∙ Nu este permis consumul de alimente si de bauturi in interiorul laboratorului; ∙ Fumatul este interzis 

∙ Se va evita aducerea unui volum mare de haine, bagaje in laboratorul de  biochimie; 

∙ Pentru reactiile in care se degaja gaze sau pentru substantele volatile se  folosesc nise speciale. In nise se va stoca o cantitate minima de reactivi. ∙ Pentru manipularea substantelor solide se folosesc spatule din metal sau  plastic. Aceste substante nu se vor atinge. 

∙ Intotdeauna se va citi de doua ori eticheta reactivului folosit in experiment; ∙ Halatele de laborator trebuie sa aiba lungimea necesara; 

∙ Parul lung se poarta strans langa corp pentru a se evita incendierea; ∙ Se vor evita operatiunile langa flacara. Inainte de a folosi un solvent organic  studentii trebuie sa se asigure ca nimeni nu foloseste o flacara de gaz; ∙ Solutiile corozive sau toxice nu vor fi aruncate in instalatia de scurgere din  laborator; 

∙ Reziduurile chimice se depun in containere special amenajate; ∙ Nu mirositi direct chimicalele din sticle! 

∙ Mercurul, plumbul si alte metale grele sunt toxice pentru organismul uman; ∙ In laborator vor lucra minim doua persoane in cazul manipularilor riscante; ∙ In cazul unor accidente mici (taieri, arsuri) trebuie utilizata trusa de prim  ajutor din laboratoare  

Leziunile ochilor- se neutralizeaza substanta cu compusul corespunzator  (pentru baze se foloseste acid boric 2% iar pentru acizi se foloseste sulfat de  magneziu 5%) si se clatesc repetat ochii cu apa pentru timp indelungat (cel  putin 30 min); 

Leziunile pielii-se indeparteaza substanta cu un compus care o neutralizeaza  (pentru baze se foloseste acid acetic 1% iar pentru acizi se foloseste NaHCO3  2%) si se clateste sub un jet de apa; se indeparteaza hainele contaminate; 

∙ Se vor supraveghea sursele de curent electric pe parcursul functionarii. Aceste  surse nu vor fi manipulate decat cu mainile uscate. 

∙ La accidentele electrice-se inchide siguranta; 

∙ La otraviri-se iau masuri pentru limitarea efectelor otravirii 

Substantele otravitoare nu se tin pe masa de laborator! 

∙ In cazul arsurilor se pune gheata intr-un prosop si se aplica pe partile arse in  scopul atenuarii durerii si se transporta persoana la spital; 

∙ In cazul unor hemoragii se reduc pierderile de sange (rana trebuie sa fie la un  nivel superior inimii); 

∙ In timpul si la finalul laboratorului se impune spalarea mainilor. Pictogramele si coduri de indentificare 

Exista 4 grupe de risc si acestea sunt reprezentate prin pictograme. Etichetele recipientelor care contin substante trebuie inscriptionate cu “fraze de  securitate” corespunzatoare. De exemplu: “S”-prudenta (S1-a se pastra sub cheie), 

“R”-natura riscului (R1-exploziv in stare uscata; R48/20/21/22-nociv:pericol de efecte  grave asupra sanatatii la expunere prelungita prin inhalare, in contact cu pielea si prin  inghitire). Etichetele trebuie sa aiba fondul rosu, portocaliu sau galben, iar inscrisurile  trebuie sa fie negre: 

Figura 1.1. Exemple de pictograme si simboluri folosite in laborator 

1.2. Materiale necesare in laboratorul de biochimie 

∙ Halat de laborator; 

∙ Calculator de buzunar; 

∙ Rigla; 

∙ Foarfeca; 

∙ Creion; 

∙ Marker stabil la apa; 

∙ Lipici. 

Ochelarii de protectie si manusile trebuie sa fie nelipsite din laboratorul de biochimie.  Este obligatorie folosirea ochelarilor de protectie in experimentele in care se 

manipuleaza substante corozive (acizi sau baze tari, solutii concentrate de alcool) sau  toxice. 

1.3.Utilizarea reactivilor biochimici si solutiilor 

Calitatea apei 

Cel mai comun solvent utilizat la prepararea solutiilor din laboratorul de biochimie  este apa. Nu se va folosi apa de canal deoarece aceasta contine o varietate de  impuritati incluzand particule (nisip), compusi organici si anorganici sau gazele  dizolvate, microorgansime (bacterii, virusuri, protozoare, alge). Mai mult, degradarea  acestor organisme conduce la aparitia unor produsi suplimentari. Pentru majoritatea  experimentelor efectuate in laboratorul de biochimie se foloseste apa deionizata sau  distilata. Pentru experimente speciale (cromatografia de lichide-HPLC sau FPLC,  culturi de tesuturi, masuratori de fluorescenta) se va utiliza numai apa cu un grad inalt  de puritate (pastrata in sticle speciale).  

1.4. Manipularea materialelor si instrumentelor 

1. Pisetele contin apa distilata; 

2. Sticlele picuratoare contin solutii alcoolice; 

3. Sticlaria si alte materiale necesare pentru laborator se gasesc pe masa de  laborator. Sticlaria utilizata se clateste cu apa distilata, iar la sfarsitul  laboratorului se imerseaza in recipientul care contine o solutie acida diluata; 

4. Resturile solide netoxice se arunca in sacii menajeri din laborator, iar cele  toxice se depoziteaza in recipienti speciali; 

5. Sticlele se manipuleaza cu grija. Nu trebuie schimbate dopurile de la sticle.  Dupa fiecare utilizare sticlele se inchid imediat. 

Acuratetea experimentala depinde in mare masura de calitatea echipamentelor si a  instrumentarului. Se vor utiliza numai pipete de sticla sau varfuri de pipete curate,  pentru a aspira lichide din sticle, din doua motive: 

o Multe chimicale si compusi biochimici sunt utilizati la concentratii mici (de  ordinul picograme, micrograme sau miligrame). Orice contaminare a pipetei,  paharelor sau cuvelor poate modifica compozitia solutiei rezultate si implicit  determina erori mari in experimente; 

o Multe biochimicale si procese biochimice sunt sensibile la agenti de  contaminare (ioni metalici, detergenti, compusi organici). 

Sticlaria si lucrurile din plastic trebuie spalate cu o solutie cu detergent  (concentratie mai mica decat 0,5% in apa), clatite cu apa si in final cu apa distilata.  Uscarea sticlariei se va face numai in etuve speciale folosite numai in acest scop. 6. Materialele din plastic

Figura 1.2. Materiale  

din plastic frecvent  

folosite in laboratorul de  

biochimie 

a) Flacon 50 ml; 

b) Tuburi tip  

Eppendorf  

c) Petriuri din plastic  

Flacoanele de 15 respectiv 50 ml pot fi folosite pentru stocarea solutiilor tampon,  pentru medii de cultura (este necesara sterilizarea in prealabil a acestor tuburi  inainte de folosire) sau pentru centrifugarea unor volume mai mari de suspensii. Tuburile Eppendorf se folosesc atat pentru prepararea unor cantitati mici de  solutie cat si pentru dilutii (prepararea probelor pentru electroforeza-capitolul 4.1).  In cazul precipitarii unor cantitati reduse de compus biochimic (de exemplu  precipitatea proteinelor cu acid tricloracetic) tuburile Eppendorf pot fi folosite la centrifugarea probelor (la o viteza maxima de 12000 rotatii pe min).  Petriurile din plastic sterile se utilizeaza in special pentru obtinerea unor medii de  cultura solide (ex: LB agar). 

7. Cuvele se manipuleaza cu grija. Nu se va atinge  

decat suprafata optica a cuvei! Pentru masuratori  

exacte cuvele trebuie sa contina cel putin o jumatate  

din volumul total cu lichid. In cazul unui set de  

masuratori se vor citi in prima faza solutiile cele mai  

diluate dupa care se continua in ordinea crescatoare a  

concentratiei. Cuva va fi acoperita cu “parafilm”  

pentru a evita evaporarea solutiilor (fapt ce ar  

determina o imprecizie a masuratorilor) si pentru a  

permite omogenizarea continutului (prin inversarea  

acesteia de 2-3 ori). Parafilmul nu se va folosi la  

solutiile care contin solventi organici polari (cloroform,  

dietil eter, acetona). Cuvele de sticla se spala cu o  

solutie cu detergent 0,5%, pe o baie de ultrasunete,  

clatite cu apa distilata si cu solutie alcoolica pentru o  

uscare mai rapida. Cuvele din plastic nu se vor spala  

decat cu detergent si se vor clati cu apa distilata.  

8. Spectrofotometru 

Inainte de utilizarea spectrofotometrului trebuie verificate  

urmatoarele aspecte: 

- Trebuie verificata lungimea de unda; 

- Trebuie verificata pozitia cuvei (astfel incat fasciculul  

AB C 

sa traverseza suprafata optica); 

Se porneste calculatorul, dupa care se porneste  spectrofotometrul (intrerupatorul se afla in partea din  spatele instrumentului langa cablul de alimentare).  Instrumentul va intra in regim in circa 10-15 min.  

Figura 1.3. Tipuri de cuve  (A –cuartz; B-plastic) si folie  folosita la acoperirea cuvelor  (C-Parafilm)  

Pentru masurarea la o singura lungime de unda se apasa pe icoana “Instrument  control” si se confirma (“OK”) tipul de suport pentru cuve utilizat (termostat de tip  Peltier), dupa care se procedeaza astfel: 

- Se apasa “λ” pentru fixarea lungimii de unda dorite; 

- Se apasa “Ref” pentru proba care contine solutia de referinta; - Se apasa “Read” pentru a citi absorbanta probei de analizat. 

Pentru urmarirea unei reactii enzimatice se apeaza icoana “Time Drive”, se fixeaza  parametrii doriti (lungime de unda, intervalul de masura sau temperatura)

1. Fixare lungime de unda 

2. Stabilirea  

 referintei 

Intervalul  

citirii 

Pasul  

citirii 

3. Citirea  

 absorbantei 

Fixare lungime de unda 

Temperatura din cuva

Figura 1.5. Modalitati de masurare cu ajutorul spectrofotometrului UV-VIS 1. citirea la o singura lungime de unda 

2. modificarea in timp a valorii absorbantei la aceeasi lungime de unda  

9. Trasferul calitativ al lichidelor 

Practica biochimica se bazeaza pe multe metode analitice. 

Figura 1.6. ilustreaza tipurile de pipete si adaptori utilizati in laboratorul de biochimie. Bulbii mai mici din cauciuc sunt utilizati pentru pipetele Pasteur, pipete cu care se  aspira volume de 1-2 ml. Para din silicon este folosita pentru pipetele gradate sau cu  volum fix. Trebuie evitata patrunderea solventului in bulbul/para pipetei. De aceea se  

aspira un volum de lichid astfel incat sa se depaseasca linia de umplere cu circa 2-3  cm. Se elibereaza lichidul pana cand meniscul se situeaza pe aceasta linie. Pentru  transferul lichidului se atinge recipientul sau paharul cu varful pipetei si se elibereaza  lichidul. Pipetele Mohr sunt cele mai utilizate in laboratorul de chimie (pentru volume  intre 0,1-10 ml). Pipetele serologice sunt gradate invers comparativ cu pipetele Mohr Curatirea pipetelor 

Imediat dupa utilizare pipetele sunt plasate intr-un cilindru vertical si se acopera cu o  solutie diluata de detergent (< 0,5%). Dupa clatire cu apa de canal se continua cu apa  distilata. 

B 

C A 

D 

E 

F G 

Figura 1.6. Dispozitive pentru masurarea volumelor si adaptorii A. Pipete de sticla (volumetrica, Mohr sau seroloegica); B. Pipeta Pasteur;  

C. Seringa Hamilton; 

D. Para pentru pipetare; 

E. Bulbi pentru pipeta Pasteur; 

F. si G. Dispozitive mecanice folosite la pipetare 

Pipetele automate 

Pipetele automate sunt folosite cu varfurile corespunzatoare. 

 Tabel 1.1. Tipuri de pipete automate folosite frecvent in laborator  

Pentru evitarea erorilor suplimentare pipetele automate se vor folosi numai in  intervalul de volum indicat. 

Reglarea pipetelor  

Pe cadranul pipetelor apar 3 cifre, iar volumul se citeste de sus in jos (sau de la stanga  la dreapta). Cele trei cifre sunt cu negru si/sau rosu. 

Exista doua etape principale care apar in decursul pipetarii: 

Pipetarea corecta 

Aspirarea-Se actioneaza  

pistonul pipetei pana la primul  

punct (pasul 1) fara a imersa  

pipeta in lichid. Se elibereaza  

incet pistonul pentru a aspira  

proba. 

Expulzarea-Se actioneaza  

pistonul pipetei pana la primul  

punct (pasul 1) dupa care se  

asteapta circa 1 secunda si se  

continua pana la cel de-al doilea  

punct (pasul 2) in scopul de a  

indeparta si resturile de lichid  

ramase pe varf. 

Pentru transferul rapid si exact  

al unor volume mai mari decat  

5 ml se pot folosi dispozitive  

speciale. Acestea sunt  

disponibile in diferite marimi si  

sunt folosite pentru transferul  

materialelor  

Figura 1.7. Folosirea pipetelor automate A-Aspirarea B-Expulzarea 

 corozive. 

Flacoanele cotate pot fi folosite de asemenea pentru masurarea volumelor mici.  Pentru volume mai mari se utilizeaza atat flacoanele cotate cat si cilindri gradati. Nu  se vor folosi flacoanele cotate pentru reactii chimice sau pentru incalzirea solutiilor. Pentru transport nu se vor folosi cilindri – se prefera paharele. 

Biuretele pot fi utilizate in aceleasi scopuri ca si pipetele. Asemeni pipetelor, biuretele  sunt instrumente precise de masurare a volumelor de lichid. Avantajul utilizarii  biuretelor este intervalul larg de masurare al volumelor. Dezavantajul este acuratetea  mai mica comparativ cu pipetele automate. Biuretele se folosesc in special pentru  determinarea cantitativa, prin titrare, a unor compusi biochimici.

10. Calcularea concentratiilor 

In biochimie concentratiile se exprima cu ajutorul unor unitati de masura diferite: ∙ Molaritatea (M) – concentratia bazata pe numarul de moli solut dizolvati intr un litru de solutie. 

Exemplu: o solutie de glicina 1 M (Mglicina = 75,07) contine 1 mol de glicina  sau 75,07 g glicina dizolvata intr-un volum de 1L. 

1 mM = 1 x 10-3 M; 1 µM = 1 x 10-6 M;  

1 nM = 1 x 10-9 M; 1 pM = 1 x 10-12 M. 

O solutie de glicina 3 mM contine 3 x 75,07 x 10-3g (0,2252 g) de glicina intr un volum de 1L. In situatia in care se prepara un volum de 100 ml de solutie  de aceeasi concentratie se vor cantari 0,02252 g (22,52 mg) de glicina si se vor  dilua la volumul corespunzator. 

∙ Procente gravimetrice (%g/g)- concentratia bazata pe numarul grame solut  dizolvat in 100 g solutie. O solutie stoc de 10% SDS (SDS-dodecil sulfat de  sodiu-detergent utilizat in electroforeza proteinelor) contine 10 g detergent  dizolvat in 100 g solutie.  

Tabel 1.2. Conversia intre dilutie, procentul 

∙ Procente volumetrice (%g/vol)- 

concentratia bazata pe numarul grame  solut dizolvat in 100 ml solutie. O  solutie de 10%g/vol de APS (persulfat  de amoniu-utilizat drept initiator in  reactia de polimerizare a acrilamidei)  contine 10 g compus la 100 ml solutie. 

∙ Greutate volumetrica (g/vol)- concentratia bazata cantitatea de solut  

volumetric si greutate volumetrica 

(g, mg) dizolvata intr-un volum de solutie (ml sau l). De exemplu concentrata  de 30 mg/ml BSA (albumina serica bovina) se obtine prin dizolvarea a 30 mg  proteina in 1 ml (1000 µl) solutie. 

Prepararea si pastrarea solutiilor 

Solutul este cantarit pe hartie de cantarire sau pe farfuriute speciale din plastic. In  cazul lichidelor se vor folosi pipete daca densitatea este cunoscuta. Pentru  substantele cu vascozitate ridicata (Glicerina, PEG-polietilenglicol) se prefera  cantatirea acestora inainte de prepararea solutiei.  

Se recomanda pastratea solutiilor tampon etans la 4 grade C pentru a evita  dezvoltarea bacteriilor si a diminua degradarea reactivilor. Unele solutii trebuie  depozitate sub 0 grade C (solutiile stoc de ATP, unele enzime, solutiile de ADN,  solutia de APS 10%). Solutiile trebuie intotdeauna etichetate cu denumirea,  concentratia solutiei, data si numele experimentatorului.  

Cantarirea 

Balantele analitice sunt cele mai frecvent utilizate pentru cantarirea reactivilor  solizi sau lichizi (in cazul in care nu se cunoaste densitatea solutiei sau solutia este  vascoasa). In biochimie in marea majoritate a cazurilor se folosesc cantitati reduse  de reactivi si din acest motiv cantarirea trebuie sa fie adecvata (de exemplu 5 mg  = 0,00500 g; 40 mg =0,0400 g; 200 mg = 0,200 g). Nu se vor folosi pahare  fiebinte pe balanta pentru a nu deregla sistemul mecanic al acesteia. In situatia in  care pe parcursul cantaririi se depun substante pe talerul balantei se recomanda  folosirea pensulei pentru curatirea acesteia.

11. Centrifugarea 

Centrifugarea este un proces care utilizeaza forta centrifuga pentru a separa  lichidele pe baza densitatii materialului. De exemplu, proteinele sau acizii nucleici  pot precipita in anumite solutii tampon sau organice. Aceste biomolecule pot fi  sedimentate prin centrifugare. Unul dintre aspectele importante in cazul  centrifugarii este balansarea centrifugii (un tub cu aceeasi greutate este plasat  diametral opus fata de un alt tub; exista insa si situatii cand tuburile nu se plaseaza  diametral opus, ci simetric – trei tuburi pot fi plasate la distante egale). In cazul in  care centrifuga nu este calibrata corespunzator exista probabilitate mare de  producere a unor accidente grave. In cazul in care in decursul centrifugarii se aude  un zgomot suspect se va opri imediat centrifuga. In situatia in care se va efectua  centrifugarea la temperaturi scazute (folosite in special la prepararea extractelor  enzimatice) capacul centrifugei va fi inchis dupa ce probele au fost centrifugate.  In caz contrar sistemul de racire al centrifugei poate fi afectat. 

Intrebari: 

1. Ce masuri de protectie trebuie luate in cazul manipularii unei solutii de acid  clorhidric? Cum neutralizati aceasta solutie in cazul unui accident? 2. Ce tip de apa distilata se utilizeaza in cromatografie? 

3. Cum se omogenizeaza continutul din cuvele de plastic in vederea citirii  absorbantei? 

4. Ce tip de cuva se foloseste pentru masurarea absorbantei la 270 nm? 5. Care din urmatoarele materiale de laborator este adecvat pentru masurarea  unui volum de 2 mL solutie: 

a) Pipeta Pasteur; 

b) Pipeta automata; 

c) Seringa Hamilton. 

6. Care din urmatoarele materiale de laborator permite masurarea cu o precizie  satisfacatoare a unor volume mai mari de solutie: 

a) Flacoane cotate; 

b) Cilindri gradati; 

c) Biuretele. 

7. Descrieti modul de preparare a 100 mL de solutie: 

a) 50 mM glicina; 

b) 1% clorura de sodiu; 

c) 10 μM citocrom c. 

8. Preparati 1 mL de solutie de clorura de sodiu de concentratie 5%. 9. Cum sunt stocate solutiile tampon? De ce? 

10. Care din urmatoarele materialele pot fi folosite la stocarea unor volume reduse  de solutie: 

a) Tuburi de 50 mL; 

b) Tuburi de 15 mL; 

c) Tuburi Eppendorf. 

11. Cum procedati pentru a calibra o pipeta automata de volum maxim 1000 μl? 12. Cantariti la balanta analitica 20 mg de clorura de sodiu si 300 mg de sulfat de  cupru. Convertiti cantitatile in grame. 

13. Cum procedati in situatia in care o centrifuga tepideaza la cateva secunde dupa  ce a fost pornita? In ce situatii se utilizeaza temperaturi scazute in timpul  centrifugarii?

Bibliografie: 

1. Hill, Jr., R. H si Finster, D. (2010) Laboratory safety for Chemistry students,  John Wiley & Sons, Hoboken, N.J. 

2. Coyne, G. S. (1997) The laboratory Companion: A practical guide to  materials, equipment, and technique, John Wiley & Sons, USA. 3. Word Health Organization (2003) Manual of basic techniques for a health  laboratory, Second Edition, Geneva. 

4. National Academy of Science (1995) Prudent Practices in the Laboratory:  Handling and Disposal of Chemicals, the Courtesy of the National Academy  Press, Washington, D.C. 

5. Ministerul muncii si protectiei sociale. Departamentul protectiei muncii (1996)  Norme specifice de securitate a muncii pentru laboratoarele de analize fizico chimice si mecanice, Bucuresti. 

6. Ministerul muncii si protectiei sociale (1996), Legea protectiei muncii  nr.90/1996 si normele metodologice de aplicare, p.43, Bucuresti. 7. Tipuri de pipete si modul de pipetare